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培養基的制備、使用常見問題解答

發布時間:2021-08-23瀏覽次數:3407返回列表

一、培養基的制備
正確制備培養基時微生物檢驗的基礎步驟之一。使用脫水培養基和其他成分,尤其是含有有毒物質(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應遵守良好實驗室規范和生產廠商提供的使用說明。培養基的不正確制備會導致培養基出現質量問題。
使用商品化脫水合成培養基制備培養基時,應嚴格按照廠商提供的使用說明配置。記錄所有相關數據,如質量/體積、pH、制備日期、滅菌條件和制備人員等。

使用各別成分制備培養基時,應按照配方準確配制,記錄所有細節信息,如;培養基名稱和類型及試劑級別、每個成分物質含量、制造商、批號、pH、培養基體積(分裝體積)、無菌措施(包括實施的方式、溫度及時間)、配置日期、人員等,以便潮源。



1.水
除特定要求,實驗室用水的電導率在25℃下應不高于25uS/cm(相當于電阻率≥0.4MΩcm)。
微生物污染應不超過103CFU/mL,好低于102CFU/mL。應根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗微生物的污染。

2.稱量和復水
稱量所需量的脫水培養基(注意防止吸入粉末,尤其是含有有害物質的培養基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養基結塊)后再加水至所需的量。

3.溶解和分裝
脫水培養基加水后適當加熱,并不攪拌使其快速溶解,必要時,重新溶解。含瓊脂的培養基在加熱溶解前應浸泡幾分鐘。

4.pH的測定和調整
用pH計測定pH,必要時在滅菌前調節pH,除特殊說明外,培養基滅菌后冷卻至25℃時,要求pH的變化不超過0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L(約1mol/L)的氫氧化-鈉溶液或濃度約為36.5g/L(約1mol/L)的鹽酸溶液調節pH。如果滅菌后調節pH,溶液需滅菌。
注:商品化培養基在高壓滅菌前后pH可能發生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時,滅菌前無需調節pH。

5.分裝
將配置好的培養基分裝到適當的容器中,容器的體積至少為體積的1.2倍。

6.滅菌
①概述
培養基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。
有些培養基無需高壓滅菌,可煮滅菌。如,含亮綠的腸道菌培養基對光和熱特別敏感,應在煮沸后快速冷卻,避光保存。同樣,一些試劑則不需要滅菌,直接使用(參見相關標準或生產廠商的使用說明)。
②濕熱滅菌
濕熱滅菌在高壓鍋或培養基制備器中進行。高壓霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培養基的體積超過1000mL,要對滅菌條件進行適當的調整。所有操作均要按照標準和使用說明的規定進行。
注:大容量培養基(>1000mL)滅菌時可能會造成過度加熱。
加熱后應采取適當的方式冷卻,防止沸溢。這對大容量培養基和敏感性培養基(如含亮綠的培養基)是非常重要的。

③過濾滅菌
過濾滅菌可以在真空負壓或正壓條件下進行。使用無菌設備和0.2um孔徑的濾膜。將過濾裝置的各個部分消毒滅菌,或使用預消毒設備。
一些濾膜上附著蛋白質或其他物質(如抗生素)。為達到有效過濾,應事先將濾膜用無菌水潤濕。

④監測
應對經濕熱或過濾滅菌的培養基進行監測,尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標進行監測。

7.添加劑的制備
制備含有有毒物質(特別是抗生素)時應小心操作,避免因粉末的擴散造成實驗人員過敏或發生其他不良反應。采用適當的預防措施并小心按照產品使用說明操作。不要使用過期的試劑;抗生素工作溶液現配現用;批量配置的抗生素溶液分裝后向冷凍保存,但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應提供冷凍對抗生素活性影響的相關資料,也可由使用者自行測定。

二、培養基配置中常見的問題
1.培養基的pH什么時候測?用什么測?怎么測?
答:對于培養基應該滅菌前測定和調整,滅菌后在測定,如果范圍超出正負0.2則培養基品質不良。

2.滅菌后的培養基是否都要測pH值?如何測定pH值?
答:每個制備批次的培養基都應測定pH,可采用pH試紙或pH計測量。

3.稀釋液滅菌后pH值是否有變化?有何影響?(如pH7.0氯化-鈉-蛋白胨緩沖液,pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液)
答:一般pH有下降現象,約0.2左右,不同培養基pH變化可能不同。

4. 孟加拉培養基是否可以取代玫瑰紅鈉瓊脂進行培養霉菌和酵母菌?
答:根據中國藥典,采用玫瑰紅鈉瓊脂。

5. 配制PH值7.0氯化-鈉-蛋白胨緩沖液時有時因為高壓滅菌器滅菌過程溫度過高而導致培養基混濁了,這種情況緩沖液還能用嗎?
答:建議按正常溫度滅菌,混濁培養基建議不要使用。

6.含瓊脂培養基在冷藏中形成冰晶怎么處理?銷毀還是加熱再用?
答:建議不要使用。

7.融化的培養基為什么不能再冷水中冷卻?
答:防止受熱不均引起結塊。

8.滅菌后,滅菌鍋需自然冷卻降壓才可以打開,這段時間是否會造成過度滅菌。
答:自然冷卻過程已經計算在正常滅菌時間內了,不會造成過度滅菌。

9.培養基所用器具若使用濕熱滅菌,是否必須待干燥后才可以使用?若烘干或其它方法,中間過程怎樣防止微生物污染?
答:如果是馬上使用且不是用于非水溶性供試液的制備及實驗,不一定要烘干;否則,應干燥后使用,滅菌及干燥盡量在同一鍋里進行,或用紗布和牛皮紙包扎緊密。

10.培養基的避光儲存,是否配置好的培養基其全部放避光儲存?
答:好都避光保存。無條件時,光敏感的培養基一定要。

11.商品培養基干粉說是加蒸餾水溶解,實際操作是否可以用純化水或注射用水?
答:只要不含有任何可能抑制或影響微生物生長的物質的水均可。

12.培養基及器具滅菌可否同一設備同滅菌時間進行滅菌?
答:蕞好分開滅菌,條件不允許時可同爐滅菌,前提是都是潔凈無污染的。

13.培養基的保溫能否用60℃的培養箱,它與45℃—55℃水浴鍋保溫方法有何不同?
答:可以用恒溫培養箱保溫,但保溫溫度一般是50℃左右,且時間不能過長,一般是不超過4小時。

14.培養基的貯存是否需要放置于2—10℃冰箱內?
答:需冷藏保存的培養基外包裝上會寫明。

15.培養基滅菌后成份會有所蒸發減少,如何處理這個問題?
答:正常情況下蒸發量較少,可忽略不計。

16.培養基融化后出現渾濁是有哪些方面的原因引起的?應如何避免?
答:可能的情況有
1.培養基配置用水不符合規定;
2.滅菌過程溫度升溫慢或降溫慢;
3.培養基儲存不當;
4.融化時沸騰時間較長等。

17.準備好的培養基有效期如何驗證?
答:定期取出培養基驗證其無菌性,促生長能力等方面。

18.培養基配制好滅菌后,在高壓容器中保溫降至50℃左右,可不可行?
答:建議好不要,避免過度受熱。

19.脫水培養基對濕度是否有要求?多少適宜?
答:按要求室溫干燥環境儲存即可。

20.培養基pH值測定溫度在25℃,這個溫度應怎么控制?比如固體培養基,固體培養基使用過程中還能調節pH值嗎?
答:可水浴控制培養基溫度。

21.配制培養基過程中,按說明書稱定量,加規定的純化水,煮沸溶解,為了避免煮沸過程總減少水分,是否要在配制過程適當增加水?比如陪硫乙醇酸鹽流體培養基。
答:可適量增加,自己掌握。

22.商品培養基一定要當天配當天用嗎?可否在一周內用完?
答:不是即配即用的培養基的話,儲存得當,可以使用。

23.稱量培養基時,注意不要吸入粉末,這粉末是指何物?
答:就是你所稱量的干粉培養基 ,因為培養基的粉末對呼吸道有刺激作用,而且培養基中的某些成分,如亞硒-酸鹽、疊氮化-鈉、乙酰胺等,長期吸入并在體內累積到一定量會對人體健康有危害。所以培養基配制稱量需做好個人防護,且好選擇少粉塵環保型顆粒培養基。

24.煮培養基,用不銹鋼鍋在電磁爐上煮可行?硫乙醇培養基是否要煮沸?如何煮沸?用不銹鋼鍋在電磁爐上煮沸可行嗎?可不可以水浴煮沸呢?
答:硫乙醇應煮沸,量大時,我實驗室用不銹鋼鍋在電磁爐上煮沸。不建議水浴煮沸,因為水浴煮沸瓊脂粉很難溶,導致瓊脂分裝不均勻,前段分裝的瓊脂含量少,后段分裝的瓊脂含量高,導致有的管或瓶中的凝固。

25.如培養基在高壓滅菌器中溫度需自然下降20度才開蓋嗎?
答:高溫滅菌器有安全閥,溫度下降到安全閥可打開時將培養基取出室溫冷卻,各型號滅菌器安全開蓋溫度不盡相同

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