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原核表達實驗心得!

發布時間:2021-10-13瀏覽次數:195返回列表

人們合成與生物相關的物質是從尿素開始的,1828年,德國化學家維勒人工合成了存在于生物體的這種有機物。在1960年我國科學家采用化學方法shou次成功地合成了具有生物活性的蛋白質——胰島素。隨著內切酶的發現和基因工程技術的發展,人們發現用各種不同的載體在原核、真核系統中進行蛋白表達為行之有效。而這其中大腸桿菌表達系統發展得為迅速、成熟。原核表達具有操作方便、快捷,需時較短,表達量大,適合工業化生產等優點。雖然也有缺少糖基化和表達后加工等問題,當有了其它多種表達系統后,原核系統仍是我們合成外源蛋白的shou選。

    在網上看到有人把原核表達技術分成四個等級:初次嘗試掃盲、亂棍打棗入門、系統優化中級和自成一體高手,覺得十分有意思。但是根據筆者自己的經驗以及耳聞目睹的一些經歷告訴我:做表達?那是謀事在人,成事在天。有時候你把克隆做出來了,雙酶切鑒定沒問題,測序沒問題,可是就是看不到表達帶。原因當然可以分析,實驗也是可以改進,但是竄改一下戈爾泰的話:“成功的實驗都是一樣的,失敗的實驗各有各的不幸?!痹趯嶒炗龅狡款i的時候要如何進行分析,找到問題的癥結是我們的實驗關鍵所在。在準備進行原核表達的時候需要考慮的因素很多,市面上可供選擇的載體、菌株也很多,要如何進行正確的選擇,找到適合自己的載體是十分重要的。所以,現在要對目前常用的一些載體進行介紹,讓我們對其相關產品及其表達原理進行了解,以方便實驗設計。

    首先來一些大腸桿菌表達的基本概念:一個完整的表達系統通常包括配套的表達載體和表達菌株,如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑,如果是融合表達還包括純化系統或者Tag檢測等等。選擇表達系統通常要根據實驗目的來考慮,比如表達量高低,目標蛋白的活性,表達產物的純化方法等等。主要歸結在表達載體的選擇上。

表達載體:我們關心的質粒上的元件包括啟動子,多克隆位點,終止密碼,融合Tag(如果有的話),復制子,篩選標記/報告基因等。通常,載體很貴,我們可以通過實驗室之間交換得到免費的載體。但是要小心,輾轉多個實驗室和多個實驗室成員之手的載體是否保持原來的遺傳背景?MCS是否還是原來那個MCS?是我們要特別注意的。

復制子:通常表達載體都會選用高拷貝的復制子。pSC101類質粒是嚴謹方式復制,拷貝數低,pCoE1,pMBI(pUC)類的復制子的拷貝數高達500以上,是表達載體常用的。通常情況下質??截悢岛捅磉_量是非線性的正相關,當然也不是越多越好,超過細胞的承受范圍反而會損害細胞的生長。如果碰巧需要2個質粒共轉化,就要考慮復制元是否相容的問題。

篩選標記和報告基因:氨芐青霉素抗性是常見的篩選標記,卡那霉素或者是新霉素次之,通常是另一個載體的篩選標記用。四環素,紅霉素和氯霉素等已經日漸式微??剐曰虻倪x擇要注意是否會對研究對象產生干擾,比如代謝研究中要留意抗性基因編碼的酶是否和代謝物相互作用。在表達篩選中要注意的問題應該就是LB倒板前加抗生素的溫度,溫度過高容易導致抗生素失效。今天耐青霉素的超級細菌泛濫,不知道是否有我們實驗人員的功勞呢?大家“隨便倒掉”已經獲得氨芐抗性的大腸桿菌之前有沒有經過煮沸或者消毒等處理呢?從以前的一針50萬單位到現在100多萬個單位,青霉素劑量似乎越來越大了。

對于做表達來說,如果不是要研究啟動子的強弱,通常比較少關心或者用到報告基因吧。綠色熒光蛋白是常用的報告基因了(注意選擇適用原核表達版本的GFP),其他還有半乳糖苷酶啊,熒光素酶啊等等。一些融合表達Tag也有報告基因的功能。

啟動子、終止子和核糖體結合位點

啟動子:啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉錄模式上看有組成型表達和誘導調控型表達。lac和Tac,PL和PR,T7是chang用的啟動子

組成型表達:表達載體的啟動子為組成型啟動子,也就是一直努力不停表達目的蛋白的啟動子,如pMAL系統。持續性表達通常表達量比較高,成本低,但是不適合表達一些對宿主細菌生長有害的蛋白。因為過量或者有害的表達產物會影響細菌的生長,反過來影響表達量的積累。

誘導調控型表達:表達載體采用誘導型啟動子,只有在誘導劑存在的條件下才能表達目的產物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達對菌體生長的影響,又可減少菌體蛋白酶對目標產物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達。另外也有啟動子是組成型的,但是啟動子所依賴的轉錄酶是誘導表達的,也屬于誘導表達系統。

融合表達:表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽(Tag),表達產物為融合蛋白(有分N端或者C端融合表達),方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag(如GST)以獲得穩定表達;而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是廣泛采用的Tag。

分泌表達:在起始密碼和目的基因之間加入信號肽,可以引導目的蛋白穿越細胞膜,避免表達產物在細胞內的過度累積而影響細胞生長,或者形成包含體,而且表達產物是可溶的活性狀態不需要復性。通常這種分泌只是分泌到細胞膜和細胞壁之間的周質空間。

可溶性表達:大腸桿菌表達效率很高,特別是強啟動子,目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒,包含體容易純化但是復性效率不高。分泌表達可以得到可溶的產物,也有部分融合Tag有助于提高產物的可溶性,比如Thio,pMAL系統。

轉錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達有重要作用——控制轉錄的RNA長度提高穩定性,避免質粒上異常表達導致質粒穩定性下降。放在啟動子上游的轉錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀,降低本底。轉錄終止子有兩類,Rho因子作用下使轉錄終止mRNA和根據模版上的對稱序列形成發夾結構而終止mRNA。常見的是rrnB  rRNA操縱子的T1T2串連轉錄終止子。

核糖體結合位點:啟動子下游從轉錄起始位點開始延伸的一段堿基序列,其中能與rRNA16S亞基3'端互補的SD序列對形成翻譯起始復合物是必需的,多數載體啟動子下游都有SD序列,也有些載體沒有,適合自帶SD序列的基因表達,要留意。

表達菌株:我們往往容易忽視的一點。不同的表達載體對應有不同的表達菌株,一些特別設計的菌株有助于解決一些表達難題,這一點生物通會有專門的介紹。同樣的,交換獲得的免費菌株,要小心其遺傳背景是否已經發生改變?當心。

注:以上各種特性是可以相互組合的,不是排他的

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