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凝膠遷移實驗(EMSA)實驗相關資料

發布時間:2022-08-16瀏覽次數:437返回列表

  標簽:蛋白-DNA 古朵生物 凝膠電泳

  凝膠遷移實驗(EMSA)實驗相關資料


  凝膠遷移實驗有稱凝膠阻滯實驗或電泳遷移率實驗(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一種用于蛋白與核算相互作用的技術。初是用于轉錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗,也可應用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。

  一、實驗原理

  EMSA主要基于蛋白-探針復合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據實驗設計特異性和非特異性探針,當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時,樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質與探針形成蛋白-探針復合物;這種復合物由于分子量大,在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢,而沒有結合蛋白的探針則較快;孵育的樣本在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后,蛋白-探針復合物會在膜靠前的位置形成一條帶,說明有蛋白與目標探針發送互作。

  二、實驗操作步驟

  1、實驗前準備

  (1)合理的實驗方案

  根據研究目的合理設計特異性探針實驗組以及非特異性探針對照組,如有必要還可以添加特異性抗體組、特異性核酸競爭組等

  (2)樣本制備

  可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白。對樣本蛋白進行定量,實驗中等量加入蛋白。

  (3)探針制備

  根據實驗要求設計不同的探針并添加標記,可以合成核酸后自行添加,部分已知蛋白有商業化的抗體也可以直接購買?,F在大多數實驗室已經不再使用放射性標記,生物素使用相對較多。

  2、形成蛋白-探針復合物

  (1)在0.5ml離心管中按順序將下列組份混勻:

  蛋白樣本(2-5μg)Xμl

  poly d(I-C)1μl

  Binding Buffer2μl

  Nuclease-Free ddH2OXμl

  總體積9μl

  (2)冰浴5min后,加入1μ探針。(對照組加1ul對照探針)

  (3)PCR儀中室溫(20-23℃)溫育30min。

  3、制備凝膠,電泳

  (1)制備6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠:(注意根據試劑情況按比例調整總體積)

  5XTBE1ml

  30%Acrylamide/Bis2.2ml

  deionized,sterilewater6.62ml

  80%Glycerol80μl

  10%AP90μl

  TEMED10μl

  總體積10ml

  (2)按標準步驟制備凝膠。

  (3)加樣前先在預冷的0.5X TBE buffer中120V預電泳10min,與電泳完畢后沖洗加樣孔。

  (4)混合樣本及電泳緩沖液,點樣電泳。

  (5)將電泳槽置于冰上或者4℃環境中,恒壓100V進行電泳,直至緩沖液指示帶距離凝膠底部2~3cm為止。(大約50-60min,根據實際情況調整電泳時間及電壓;電泳時間不宜過長)

  4、轉膜

  (1)在預冷的0.5XTBE中浸泡凝膠,膜,濾紙和纖維墊。

  (2)按如下順序組裝“三明治”:纖維墊,濾紙,凝膠,膜,濾紙,纖維墊。注意電極,確保凝膠位于陰極、膜位于陽極。

  (3)在預冷的0.5XTBE中進行轉膜。轉膜裝置應置于冰上或者低溫室中,恒壓60V轉膜1h。(注意根據實際情況調整電壓及時間)。

  5、檢測

  (1)去除轉好的膜,放入合適的盛有緩沖液的容器中,沖洗。(注意整個檢測過程避免膜干燥)

  (2)去掉沖洗緩沖液,加入封閉液后輕微震蕩,室溫封閉20min。

  (3)加入適量的HRP酶標記的鏈霉親和素(Streptavidin-HRP conjugate),室溫震蕩孵育45min。(勿將酶標記物直接加到膜上)

  (4)去掉酶聯物稀釋液,用洗滌緩沖液洗膜三次,每次室溫輕微震蕩1 0min。

  (5)配置反應底物,均勻加至膜上,室溫孵育5min。(可以在加完底物后,用薄膜輕輕覆蓋在膜上,是底物均勻覆蓋,注意不要產生氣泡)

  (6)化學發光成像系統曝光成像(曝光時間的長短可以根據檢測方法不同而進行相應調整)。

  常見問題

  1、為什么看不到遷移帶?

  1)蛋白樣本提取質量不高,蛋白降解或者提取量不足。

  2)樣本中沒有可以與探針結合的蛋白。

  3)探針與蛋白無特異性的相互作用。

  4)轉膜效率低,蛋白或者探針未轉移到膜上。

  5)曝光或者成像時間過短。

  在Super-Shift EMSA測定中看不到Super-Shift DNA/蛋白復合物帶還可能有以下原因:

  6)抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA,只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA。

  7)測定的活化的DNA/蛋白復合物中沒有希望檢測的構成成分存在。此時既看不到Super-Shift的帶,也看不到DNA/蛋白復合物的量的減少

  8)使用的抗體過度稀釋。一般10-20ul的反應液需要使用0.5-1ul原倍的抗體。

  9)多抗與DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進膠。在這種情況下,雖然看不到Super-Shift的帶,但應當可以看到DAN/蛋白復合物的電泳帶明顯減少。

  2、為什么實驗背景高?

  1)曝光或者成像時間過長。

  2)封閉時間不足或者效率不高。

  3)洗滌效果不佳。

  4)實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態。

  3、EMSA測定需要多少量的蛋白與標記的探針?

  對每一個特定的結合蛋白和探針,所用的純化蛋白,部分純化蛋白,粗制核抽提液需作優化:一般所用純化蛋白的量在20-2000ng間,可將蛋白:DNA的等摩爾比調整為蛋白的摩爾數是DNA的5倍;用粗制核抽提液,需要2-10ug蛋白形成特異的復合物。

  部分純化蛋白與粗制核抽提液應保存在-80℃、探針應保存在-20℃以防止降解。

  無論探針或是結合蛋白都應避免多次凍融。

  4、Poly(dI:dC),非特異性競爭DNA,特異性競爭DNA在EMSA測定中的作用?

  Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶組成。在EMSA反應中加入poly(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中轉錄調節因子與標記探針的非特異結合。結合溶液中的poly(dI:dC)的用量需在正式實驗前進行優化,一般用量大約在0.05mg/ml左右。當用純化的蛋白作凝膠遷移反應時,不必一定加入poly(dI:dC),如加入,則普通反應中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液,每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。

  為確定所形成的復合物的特異性,在含或不含增量的特異競爭DNA或非特異的競爭DNA時,作結合反應的競爭實驗。一般,特異競爭探針是非標記的DNA,其序列與標記探針相同,故能與標記探針競爭與結合蛋白的反應。非特異競爭探針的長度組成和DNA探針相同,但序列不同。如果結合蛋白與標記探針的結合被特異競爭探針抑制,而不受非特異探針的影響表明靶結合蛋白的存在。特異與非特異性競爭DNA的用量也需優化或滴定,但競爭DNA通常是標記的探針用量的30-100倍(w/w)。

  5、用什么凝膠條件將蛋白質/探針復合物和游離的探針分離開?

  將結合蛋白或粗制核抽提液和目的探針結合,蛋白/探針復合物和游離探針可在非變性聚丙烯酰胺凝膠中經電泳分離。聚丙烯酰胺的濃度一般為6%,在特定條件下可用高或低的濃度。也可將TGE緩沖液(12.5mM Tris,pH8.3,95mM 甘氨酸,0.5mM EDTA)用于不穩定的蛋白/DNA復合物。在4℃進行結合和電泳實驗以阻止不穩定復合物和探針的解離。

  當帶型不緊密出現拖尾時,表明復合物存在解離。凝膠必需完全聚合,以避免帶型拖尾。如復合物不進入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量,或鹽的濃度過量不適用于這一反應。在含抽提液的帶中不含游離探針或復合物,但只含探針的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染,應在抽提液中和結合反應中加入相應的抑制劑。

  凝膠遷移實驗(EMSA)實驗相關資料上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品,勵志研發和銷售的綜合性生物公司,產品遠銷多個國家和地區,我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求”的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向,不斷開發高質量的新產品,提供客戶滿意的綜合服務質量”的方針。

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